Skip to content

עבודה בביוטכנולוגיה סרטן השד

עבודה בביוטכנולוגיה

תקציר

עבודת מחקר זן היא עבודה שעוסקת בחקר תאי גזע סרטניים, (CSC) Cancer Stem Cells בסרטן השד. מטרת המחקר שלנו היא לחקור את השפעת נוכחותם של החלבון  Slug על תאי סרטן שד עכברים TUBO המבטאים ביתר את הרצפטור HER2. כלומר לבדוק אם ביטוי יתר של החלבונים דוחף את תאי הסרטן לתהליךEMT  ומעודד אותם להפוך לתאי גזע סרטניים עמידים לתרופות הקיימות . אנו נעשה זאת על ידי, יצירת תאי מודל של סרטן השד TUBO המועשרים בתאי גזע סרטניים ע”י ביטוי ביתר של חלבונים מעודדי תהליך ה- EMT. החדרת הגן Slug לתאי TUBO, הגן הוחדר לתאי TUBO על ידי אינפקציה בעזרת הפלסמיד שמכיל את הקונטרקט Slug-ERα וגן לעמידות לפורומצין. בדיקת תאי המודל המכילים slug. מעקב אחרי רגישות התאים המהונדסים לתרופות רלוונטיות.

תוצאות המחקר בנוגע ל החדרת הגן Slug לתאי TUBO, היו שאפשר לומר שאכן התקבל קוו תאים חדש של TUBO/Slug שהם מבטאים ביתר את החלבון. לגבי שיטת  ‘Western blot נראה כי התאים של סרטן השד TUBO , אכן עברו אינפקציה עם החלבונים.

מבוא

עבודת מחקר זו תעסוק בחקר סרטן השד. סרטן השד הוא גידול שמקורו ברקמת השד. ישנם כמה סוגים של סרטן שד, אולם בכל הסוגים ישנה חשיבות מכרעת לגילוי מוקדם. גילוי וטיפול מוקדמים מעלים מאוד את סיכויי ההחלמה מהמחלה.

סרטן השד נוצר כאשר אחד התאים ברקמה אינו מפסיק להתחלק: הוא מתחלק שוב ושוב ללא בקרה ויוצר הרבה מאוד תאים סרטניים באזור אחד. באותו האזור נוצר גוש שבהמשך עלול לגרום להרס של רקמות בריאות סמוכות וכן לשלוח גרורות לרקמות מרוחקות. באופן הזה מתפשט סרטן השד לבלוטות הלימפה בבתי השחי וכן הוא עלול לשלוח גרורות לאיברים אחרים כמו ריאות ועצמות.

סרטן השד הוא הגידול השכיח ביותר בקרב נשים. ניתן לגלות אותו בשלבים מוקדמים באמצעות ממוגרפיה, שהיא בדיקת סקר שמומלצת לכל הנשים מגיל 50. לנשים שמצויות בסיכון מוגבר, למשל נשים שיש להן קרובת משפחה מדרגה ראשונה שחלתה במחלה, מומלץ להתחיל את המעקב כבר בגיל 40. גילוי מוקדם משפר את סיכויי ההחלמה. 

גידול בשד נגרם משיבוש בתהליכי החלוקה של התאים ברקמת השד. הגורם לשיבוש הזה אינו ידוע, אולם ידועים כמה גורמי סיכון שמעלים את הסיכון להתפתחות סרטן השד. אלה הם גורמי הסיכון הידועים: נטייה תורשתית . השמנה. הופעת הווסת הראשונה בגיל מוקדם והפסקת הווסת בגיל מאוחר יחסית. הריון ראשון בגיל מבוגר יחסית. עישון. צריכה מופרזת של אלכוהול. סרטן השד יותר שכיח בקרב נשים לבנות מאשר בקרב נשים שחורות ושכיח יותר בצפון אירופה, בארצות הברית ובישראל מאשר במזרח אסיה ובאפריקה. סרטן השד נפוץ פי 100 בקרב נשים מאשר בקרב גברים. ממחקרים מתברר כי אצל נשים מיניקות, יש שכיחות נמוכה יותר של מקרי סרטן השד. ככל שמיניקים יותר – כך קטן הסיכון לחלות.

התסמין המרכזי הוא גוש בשד. עם זאת יש להדגיש שלא כל הופעה של גוש בשד היא בהכרח סימן לסרטן. לעיתים קרובות מדובר בציסטות לא סרטניות. לכן בכל מקרה של גילוי גוש בשד יש להיבדק על ידי כירורג שד כדי שיקבע אם יש צורך בבדיקות נוספות.

תסמינים אפשריים נוספים: כאב בשד, שינויים בעור על פני השד ובמבנה השד, הפרשה דמית מהפטמה, שקיעה של הפטמה, שינויים בעור הפטמה (למשל, קילוף העור), בלוטות לימפה מוגדלות בבית השחי.

  1. ראשי פרקים לספרות בתחום:

סרטן השד – סרטן השד היא מחלה סרטנית שמקורה בשד. בשלביה הראשוניים המחלה מתאפיינת בגושים לא כואבים בשד, לאחר מכן חודרים תאים סרטניים לקשרי הלימפה של בית השחי ומשם עלולים התאים לחדור לזרם הדם ודרכו להגיע לאיברים מרוחקים כגון העצמות, הכבד, הריאות והמוח . בשלבי המחלה המוקדמים תאי האפיתל ממלאים את חלל צינוריות החלב, בהמשך חודרים תאי האפיתל את דופן צינור החלב ופולשים לרקמה התומכת. מן הגידול הראשוני יכולים להתנתק תאים ליצירת גרורות.

הסכנה העיקרית בסרטן השד היא היווצרות גרורות באיברים החיוניים שאותן לא ניתן להוציא בניתוח כמו השד עצמו שניתן לכרות אותו.

כ- 20 עד 30 אחוז ממקרי סרטן השד מייצרים עודף של HER-2. גידולים אלה נוטים לגדול מהר יותר ובדרך כלל הם נוטים לחזור, בהשוואה לגידולים אשר לא מייצרים עודף HER-2. בדרך כלל, HER2 מתבטא ברמה נמוכה על פני התאים האפיתליאלים, הם הכרחיים להתפתחות התקינה של רקמות רבות, כוללים אלה של השד, שחלה, ריאות, כבד, כליות ומערכת עצבים המרכזי. מספר רצפטורים על פני כל תא סרטני יכול להגיע עד שני מיליון. ביטוי היתר של HER2 הוא בעל חשיבות מכרעת מפני שהפעלתו מפעיל מסלולים מרובים במורד הזרם. הפעלת מסלולים אלה מובילים לריבוי אנורמאלי ובלתי נשלט של התאים הסרטניים .

לפטיניבהינה תרופה ביולוגית חדשה לטיפול בסרטן שד מתקדם ו/או גרורתי, היא מעכבת את יצירת הומו דימרים ו הטרודימרים של HER-2. מעקבת  זירחון הקינאז (HER2) . התרופה פועלת על מספר רצפטורים בו זמנית, כתוצאה מכך מעקבת מסלולEGFR   ומשבשת את שרשרת העברת האותות בתא בכך מונעת התרבות .

התרופות שניתנים לחולים בתחילת המחלה (למשל לפטיניב ו פלוטמיד ואחרות.) גורמות לסלקציה של תאים סרטניים עמידים  כנגד התרופות. התרופות מחסלות את התאים הרגישים ולא פוגעות בתאים העמידים  בכך מאפשרות סלקציה של התאים העמידים.

-Epithelial–mesenchymal transition EMT זהו תהליך המביא למעבר של תאים אפיתליאליים לתאים מזנכימאלים, תהליך זה בעל חשיבות בזמן שליחת הגרורות. תאים מזנכימאלים לא מייצרים קשרים בין תאים, הם יכולים לפלוש דרך ה- ECM, והם מבטאים פקטורים כמו vimentin, fibronectin–N-cadherin.

חלבונים ממשפחת ה-SNAIL, TWIST ו- ZEB , הם מעורבים בוויסות קאדהרינים ובפרט  E-cadherin.

חלבון Snail וכן חלבון Twist הינם חלבונים המעורבים בתהליך Epithelial–mesenchymal transition (EMT) , הגורם לשליחת גרורות וכן מאפיין סרטן בשלב מתקדם בתאי אפיתל, החלבונים ידועים כמעורבים בתהליך הסרטני בשלבים המתקדמים .

החלבוןSNAIL-zinc finger שמדכא ביטוי גנים אקטודרמאלים. החלבון מעורב בסרטן השד ו בתהליך ה- EMT , ונמצא כמבקר התבטאותם של כ-200 גנים שונים ביניהם  E-CAHEDRIN.

החלבון Twist – פקטור שיעתוק שפועל כאונקוגן במספר סוגי סרטן כולל סרטן השד,החלבון נמצא כמעורב בהתחמקות מאפופטוזיס, מה שהופך את התאים הסרטניים לעמידים בפני התרופות הכימותרפיות .

החלבון SLUGאחד הגנים ממשפחת ה- SNAIL, משרה ירידה בגנים רגולטורים של פקטורי התמיינות (כגון E-cadherin) ומעורב ברכישת פנוטיפ פולשני במגוון סוגי תאים. בסרטן השד, ביטוי גן SLUG נמצא בקורלציה עם מספר בלוטות הלימפה הפולשניים ונמצא כמעורב במצב גרורתי, אך נתונים בפועל על קשר כזה עדיין חסרים. יתר על כך, ברקמות שד נורמלית וברקמות סרטנית,הוכיחו שקיים קשר בין הפנוטיפ של תאים באזאלים לפנוטיפ של תאי גזע. נמצא כי רקמות סרטניות שונות שמבטאות רמות גבוהות של mRNASLUG הראו פנוטיפ דומה לפנוטיפ של גידול של סרטן שד מסוג  basal like breast carcinoma שזה אומר, רקמות הללו בעלות פנוטיפ דומה לפנוטיפ של תאי גזע. הרקמות הסרטניות ביטאו רמות גבוהות של גנים רגולטוריים של תאי גזע.

תאי גזע סרטנייםכיום ישנן הוכחות רבות לנוכחותם של תאי גזע סרטניים בסוגי סרטן שונים .תאי גזע סרטניים, (CSC) Cancer Stem Cells, מוגדרים כתאי סרטן ממאירים בעלי פנוטיפ של תאי גזע . כמו תאי גזע רגילים גם הם בעלי תוחלת חיים ארוכה, יכולת להתחדשות עצמית, ועמידות כנגד חומרים כימותרפיים.

הודות ליכולת העמידות שלהם לתרופות והיכולת לעורר תגובה סרטנית, נתפסים תאי ה- CSC כאחראים להתחדשות הגידול לאחר טיפול כימותרפי. כמו כן, נוטים להאמין כי תאים אלו בעלי פוטנציאל ליצירת גרורות, ייצור מוגבר של ציטוקינים, כימו קינים ופקטורי גידול הממריצים פרוליפרציה, הגירה ויצירה של כלי דם חדשים התומכים בגידול הסרטני, ועל כן יכולים לתת הסבר לעמידות לטיפולים כימותרפיים בסוגי סרטן שונים .

  1. מטרות המחקר:

במחקר המוצע, אנו רוצים לחקור את השפעת נוכחותם של החלבון  Slug על תאי סרטן שד עכברים TUBO המבטאים ביתר את הרצפטור HER2, כלומר לבדוק אם ביטוי יתר של החלבונים דוחף את תאי הסרטן לתהליךEMT  ומעודד אותם להפוך לתאי גזע סרטניים עמידים לתרופות הקיימות . נעקוב אחרי התנהגותם של תאי Tubo/Slug בהשוואה לתאי Tubo המבטאים ביתר Snail  או Twist1 שכבר קיימים במעבדה שלנו.

איתור חומרים או תרופות קיימות ולבחון השפעתם על התאים הרגישים והעמידים, ע”י מעקב אחרי השפעתם על גדילה, יצירת מושבות באגר רך בתאי סרטן השד .

3. חומרים ושיטות / טכניקות העבודה שהתלמיד ישתמש בהם (בקצרה):

  1. יצירת תאי מודל

יצירת תאי מודל של סרטן השד TUBO המועשרים בתאי גזע סרטניים ע”י ביטוי ביתר של חלבונים מעודדי תהליך ה- EMT.

טרנספורמציה של הפלסמיד המכיל את הגן ל slug לתאי Amphopact 293HEK.

תאי TUBO עברו אינפקציה בויריונים המכילים את הגנים Twist, Snail, Slug. באמצעות ויריונים המכילים את הפלסמיד. בעת הוספת הפלסמיד לתאי Amphopact 293 , אשר מכילים חלבוני אריזה ויראלים, נוצרים ויריונים המכילים את הפלסמיד. הפלסמיד שמכיל את הגנים ל- Twist  ו-Snail מכילים בנוסף גן לעמידות לאנטיביוטיקה Blasticidin. הפלסמיד אשר מכיל את הגן ל-Slug מכיל בנוסף גן לעמידות לפירומיצין.

2.      החדרת הגן Slug לתאי TUBO:

הגן הוחדר לתאי TUBO על ידי אינפקציה בעזרת הפלסמיד שמכיל את הקונטרקט Slug-ERα וגן לעמידות לפורומצין. התאים עברו סלקציה עם האנטיביוטיקה פירומיצין בריכוז μg/ml 1 וביטוי החלבון נבדק בשיטת western  blot. ביטוי החלבון Slug נבדק על ידי נוגדן נגד החלבון  Slug. בתמונת הג’ל ניתן לראות כי הייתה תגובה של התאים TUBO/Slug עם נוגדן כנגד החלבון Slug, אפשר לומר שאכן התקבל קוו תאים חדש של TUBO/Slug שהם מבטאים ביתר את החלבון . איור1.

  • בדיקת תאי המודל המכילים slug
  • לבדוק התבטאות Slug ,Snail ,Twist בתאים המהונדסים TUBO.
  • מעקב אחר ביטוי החלבונים בשיטת Western blot .
  • לבדוק תכונות התאים המהונדסים מבחינת התבטאותם של מרקרים לתאי גזע סרטניים כמו 2ABCG ומרקרים למעבר לתאי מזנכימה כמו VIMENTIN בתאי TUBO.
  • מעקב אחר ביטוי החלבונים בשיטת Western blot .

בתאים התאים נאספו ונשטפו פעמיים ב- PBS קר, אחרי השטיפות נעשה סירכוז למשך 5 דקות ב3000rpm, ב-4°C. לאחר השטיפות נעשה ליזיס לתאים. לאחר צנטריפוגה למשך 10 דקות ב- 14000rpm, ב-4°C, נאסף הנוזל העליון המכיל את חלבוני התא. הדוגמאות השונות הופרדו בג’ל חלבונים SDS-PAGE 10%, אחרי ההרצה בשלב הטרנספר העברנו את החלבונים לממברנה על מנת שנוכל לעשות שימוש בנוגדנים מתאימים לזיהוי החלבונים.

  • מעקב אחרי רגישות התאים המהונדסים לתרופות רלוונטיות.
  • חיוניות תאים בשיטת טריפן בלו (growth inhibition).

עיכוב התאים נבחן באמצעות שיטת צביעה של תאים עם טריפן בלו. טריפן בלו נכנס לתאים מתים וצובע את הציטופלסמה, הוא מצליח לחדור ממברנה לא תקינה. תאים חיים לא יצבעו מפני שהם בעלי יכולות למנוע את כניסת הצבע לתאים בעזרת הממברנה התקינה.

  • חיוניות תאים בשיטת XTT (growth inhibition).

תוצאות

החדרת הגן Slug לתאי TUBO:

במקביל להחדרת Snail ו- Twist  , התבצע אותו הפרוטוקול עם Slug, הגן הוחדר לתאי TUBO על ידי אינפקציה בעזרת הפלסמיד שמכיל את הקונסטרקטSlug-ERα וגן לעמידות לפורומצין. התאים עברו סלקציה עם האנטיביוטיקה פירומיצין בריכוז μg/ml 1 וביטוי החלבון נבדק בשיטת western  blot. ביטוי החלבון Slugנבדק על ידי נוגדן נגד החלבון  Slug. בתמונת הג’ל ניתן לראות כי הייתה תגובה של התאים TUBO/Slug עם נוגדן כנגד החלבון Slug, אפשר לומר שאכן התקבל קוו תאים חדש של TUBO/Slug שהם מבטאים ביתר את החלבון איור3.

בדיקת מאפיינים ותכונות של קווי התאים החדשים :

ביטוי גנים מעורבים בEMT  וגנים מאפיינים תאי גזע סרטניים בתאי Tubo בשיטת Western blot:

Snail, Slug ו-Twist, מגיבים לגירויים סביבתיים ומתפקדים כמתגים מולקולריים בכך הם מפעילים תהליך ה-(epithelial-to-mesenchymal transition) EMT[43]. לאחרונה, נמצא קשר בין מעבר תאי האפיתל למזנכימה (EMT)למאפייני תאי גזע סרטניים(CSC) [45][46]. אחת המטרות בעבודה זו, לבדוק אם ביטוי יתר של החלבונים (Slug, Snail  ו-Twist) דוחפים את תאי הסרטן לעבור תהליךEMT  ומעודדים אותם להפוך לתאי גזע סרטניים אגרסיבים. בדיקה זו, מצריכה מעקב אחרי סמנים ייחודיים המאפיינים את המעבר האפיתליאלי- מזנכימאלי וכאלו המאפיינים תאי גזע סרטנים אגרסיביים.

בעזרת שיטת Western blot נראה כי התאים של סרטן השד TUBO

עברו אינפקציה עם החלבונים (איור 1). תמונת הג’ל לאחר

האינפקציה עם החלבון Snail  ו-Twist. ניתן לראות כי הייתה

תגובה עם החלבון Snail וגם עם הנוגדן ל-ERα. התאים שעברו

אינפקציה עם Twist –ER נבדקו עם הנוגדן נגד החלבון ERα(אין

ברשות המעבדה נוגדן טוב ל- Twist).

איור 1: התבטאות Twist ו-Snail בתאים בשימוש בשיטת Western blot.תאי סרטן השד: TUBO, TUBO/Twist TUBO/Snail.  α-Tubulin גן לנרמול.  

החלבון ERα התקבל בשני בנדים בתאים שעברו אינפקציה

עם Snail-ERותאים שעברו אינפקציה עם Twist-ER, אך נראה כי

התקבל בגדלים שונים.לפי כך ניתן לאמת קבלת קווי תאים חדשים של סרטן השד

 שמבטאים ביתראת הגנים Twist  ו-Snail.

מעקב אחרי סמנים ייחודיים המאפיינים את המעבר האפיתליאלי- מזנכימאלי

ביטוי גבוהה של חלבון התאחיזה בין תאים (E-Cadherin), מאפיין תאים אפיטליאלים. לעומת זאת ביטוי גבוהה של (N-cadherin), מאפיין תאים מזנכימאלים. החלבונים Snail, Twist, Vimentin מעורבים

בוויסות קאדהרינים בפרט  E-cadherinוהם מבוטאים בתאים מזנכימאלים[23][21], [22]. ביטוי יתר של Vimentin, ירידה בביטוי של E-Cadherin ועלייה בביטוי של N-cadherinמעידים על מעבר מזנכימאלי. לשם כך, בשיטת ה-RT-PCRעקבנו אחרי רמת השעתוק של הגנים הללו בתאים השונים של סרטן השד וסרטן הפרוסטטה.

התאים אשר טופלו עם Tamoxifenלמשך 21 גודלו, נאספו והופק ה- RNA מהדוגמאות השונות. לאחר מכן, רמת השיעתוק של הגנים (E-cadherin, N-cadherin, Vimentin) נבדקה על ידי הגברת מקטעי הגנים בעזרת פריימרים מתאימים לכל גן (מפורטים בשיטות וחומרים) במכשיר ה- PCR. תוצרי הריאקציה של ה-PCR של הדוגמאות השונות הורצו בג’ל אגרוז, הג’ל צולם וניתן לראות את התוצאות ב- (איור4).

Vimentin תוצאות ה-RT-PCR  (איור4) הראו שהגן נמצא בכל דגימות התאים של סרטן השד TUBO, אך לא ניתן היה לראות הבדלים בביטויו בין התאים השונים. על מנת לאמת כי לא קיים הבדל בביטוי הגן Vimentin בין דוגמאות התאים השונים של TUBO , נבדקה רמת השעתוק של הגן ורמת השעתוק של גן מנרמלGAPDH  ב- Real Time PCR. לכל דגימת תאים, רמת השעתוק של ה- Vimentin יוחסה לרמת השעתוק של הגן המנרמל GAPDH  והתוצאות הוצגו באיור 5. בתאי סרטן השד, תוצאות ה-Real Time לא הראו שינוי משמעותי ברמת השעתוק של Vimentin  (TUBO, TUBO/Twist, TUBO/Snail, Tubo/Slug), כמות החלבון היחסית לGAPDH  נעה סביב ~1.3.

N-cadherin ו- E-Cadherinתוצאות ה-RT-PCR  (איור4) לא התקבל תוצר של שני הגנים, יתכן כי אותם פריימרים לא עבדו בתאים אלו.

מעקב אחרי סמנים ייחודיים המאפיינים תאי גזע סרטנים אגרסיביים.

תאי גזע, מצטיינים בהשלכת תרכובות כימותרפיות אל מחוץ לתא, דרך תעלות ספציפיות במנגנון multi drugresistance, לשם כך תאים אלו מתאפיינים בריכוז גבוה של טרנספורטרים[46]. ביטוי יתר של טרנפורטריםכמו ABCG2מעידים על קבלתם של תאי גזע סרטניים (תאים עמידים)[46]. מדענים הצליחו לבודד תאים בעלי תכונות של תאי גזע של סרטן השד בעזרת המרקר CD184+.CD184  הינו רצפטור לליגנדכימוקין אשר מעניק יכולת התנועה. הפעלת הרצפטור תגרום למעברי סיגנלים שונים בתא המשפיעים בין היתר על חלוקת התא, שעתוק ואפופטוזיס. רצפטור זה ידוע בחשיבותו בשמירה והשבת תאי מח עצם לא בשלים חזרה למח העצם וכן בהשתקתם.

CD184נבדק בתאי סרטן השד כמרקר לתאי גזע,ב- RT-PCR התקבל תוצר של הגן בכל דוגמאות התאים (TUBO, Tubo/Slug, TUBO/Twist, TUBO/Snail) אך ללא שינוי בעוצמת הבנדים.

תוצאות ראשוניות אלו, לא העידו של מעבר אפיתלאלי- מזנכימאלי ולא הראו תכונות של תאי גזע סרטניים בתאי סרטן השד. הבדיקות הן ראשוניות וטרם היו חזרות על התוצאות המתארות את רמת השעתוק של N-cadherin, E-Cadherin, CD184בניסוי RT-PCR ורמת השעתוק הכמותית לא נבדקה ב-Real Time PCR.

עיכוב גדילה של תאי סרטן השד ע”י לפטיניב בשיטת טריפאן בלו וב- XTT.

ה-XTT הינה שיטה אשר בודקת חיוניות תאים בנוכחות חומרים שונים. כמתואר בפרק השיטות, תאי סרטן השד  TUBO/Twist , TUBO/Snailו-TUBO/Slug שנזרעו לפני יום, טופלו למשך 72 שעות עם לפטיניב בריכוזים שונים (0.1, 0.5, 1, 10 µM), ובתום הטיפול, לאחר הוספת ראגנט הצבע, קראנו את עוצמת הצבע של התאים המטופלים בקורא אלייזה באורך גל של 450-500nm כאשר תאים שטופלו ב- DMSO 0.2% שימשו כביקורת. בהשוואה לתאי הביקורת נקבע אחוז עיכוב התאים בתגובה לטיפול עם התרופות וממנו חולצו ערכי ה- IC50 של החומרים. והוצגו בגרף בשגיאה! מקור ההפניה לא נמצא.שגיאה! מקור ההפניה לא נמצא. מוצגים ממוצעי ה- IC50 של ניסויי ה-XTT  שבוצעו.

טריפן בלו, שיטת צביעה נוספת של תאים המהווה מדד לחיות התאים בתרבית. כמתואר בפרק השיטות, תאי סרטן השד טופלו ל- 72 שעות עם לפטיניב בריכוזים שונים (0.1, 0.5, 1, 10 µM), בתום 72 שעות נאספו התאים ונספרו בהמיציטומטר כמדד לחיות התאים. תאים ללא טיפול שימשו כביקורת שלילית ולפיהם חושב אחוז התאים החיים ואז חולצו הערכים של ה- IC50 והוצגו בגרף  .

לפי גרף העמודות המתאר את ממוצעי ה- IC50 של ניסויי ה-XTT של לפטיניב בתאים TUBO, TUBO/Twist, TUBO/Snail, TUBO/Slug ו-TUBO/Twist-Slug, נראה שאין הבדל ביכולתה של Lapatinib לעכב את תאי Tubo השונים, ממוצעי ה- IC50 המחושבים הם Mµ 0.68,0.62, 0.59, 0.8, 0.71 בתהתאמה וסטיית התקן נמוכה. ההבדלים אם ישנם הם קטנים ויתכן ולא משמעותיים מבחינה סטטיסטית. אפשר לומר כי טיפול עם לפטיניב לא השפיע באופן שונה על התאים השונים של סרטן השד. תאי ה- mcf7 הם תאים (ER+), ערך ה- IC50 שלהם היה הכי גבוהה uM 7.5, כמעט פי 10 יותר משאר התאים, הם שימשו כביקורת חיובית.

תוצאות המבחנים של ה-XTT, טריפאן בלו היו תואמות, אין הבדל משמעותי בערכי ה-  IC50בין התאים השונים.  ניתן לומר כי לא התרחשה עמידות בפני לפטניב בתאים החדשים של סרטן השד.

תגובת התאים החדשים של סרטן השד TUBO/Twist ו- TUBO/Snail לתרופות קיימות:

בדיקת השפעת הגנים Snail, Twistו-Slug  כלל סריקה של מספר תרופות במטרה לבדוק את פעילותן, על התאים החדשים של סרטן השד (TUBO/Twist, TUBO/Snailו-TUBO/Slug). פעילות התרופות נבדקה בשיטות שונות: XTT , Trypan blue שבדקו עיכוב גדילת התאים.

בניסוי ה-XTT , נסרקו מספר חומרים (כל חומר נבדק לפחות 3 פעמים). מוצגים הממוצעים והחציון של ערכי ה- IC50 של הטיפולים השונים שהוספו לתאי סרטן השד,

מוצגים ממוצעי ה- IC50 של מס’ חומרים שהתאים TUBO/Snail ו- TUBO/Twist הציגו עמידות חלקית בפניהם.

תגובת התאים TUBO/Twist ו-  TUBO/Snailלדסטיניב  ו קריזוטיניב


על פי תוצאות  ה- IC50 שחושבו מניסוי XTT, ניתן לראות, כי תאי סרטן TUBO/Snailו- TUBO/Twistהציגו עמידות (פי 1.6 ו- 1.4 יותר מתאי TUBO) בפני קריזוטיניב, התרופה הניתנת לחולי סרטן ריאות, כאשר ממוצעיה-  IC50הםMµ5.5, 7.7, 8.7 בתאי TUBO, TUBO/Twist, TUBO/Snailבהתאמה. בנוסף לכך, התאים הציגו עמידות פי 4  ו- 3 ~ יותר מתאי TUBO בהתאמה בפני Dasatinib, תרופה המשמשת לטיפול בלויקמיה מיאלואידית כרונית (CML), כאשר ממוצעי ה- IC50 הםµM   1.38, 4, 5.45 בתאי TUBO, TUBO/Twist, TUBO/Snailבהתאמה. הבדלים בממוצעי ה-  IC50 בין התאים השונים היו זעירים ואין מובהקות סטטיסטית.

תגובת התאים המהונדסים של סרטן השד TUBO/Twist ו- TUBO/Snail לשאר החומרים

לתרופות אחרות כמו, Oxaliplatin, Carboplatin , MYJ-16 , Thalitomid ,Revilidin , Sutent לא הייתה השפעה על תאי סרטן השד שנבדקו, ממוצע ה- IC50שלהם היה מעל  µM10 בתאים TUBO, TUBO Twist, TUBO/Snail. התרופות Gemzar, Ara-C, Fu5, הצליחו לעכב את תאי סרטן השד השונים בריכוזים נמוכים, בלי שום קשר לסוג התא אם רגיל או מבטא את הגנים Snail ו- Twist. בכל התאים של סרטן השד שנבדקו TUBO, TUBO/Twist, TUBO/Snail, ערכי הממוצע וחציון של ה- IC50של Gemzar, Ara-C, Fu5, הם µM 0.3, µM 0.2, µM 0.1 בהתאמה, וסטיית התקן אינה משמעותית.

טבלה 1- ממוצע וחציון ערכי ה- IC50של החומרים שהוספו לתאי סרטן השד. הערכים נשלפו מניסויים של . XTT

 TUBOTUBO/Twist TUBO/Snail
 AVR Ic50STDVMedianAVR Ic50STDVMedianAVR Ic50STDVMedian
Ponatinib5.13.24.56.13.96.54.33.63.6
Crizotinib5.51.96.17.71.27.58.70.59.0
Dasatinib1.31.71.341.23.95.451.73.9
Nilotinib9.21.3109.22.010100.010.0
Tarceva3.82.14.04.11.94.84.02.34.1
Metformin1.10.61.11.70.41.80.80.50.8
Gemzar0.10.10.10.10.00.10.10.00.1
Ara-C0.20.10.30.20.10.20.20.10.2
5Fu0.300.30.300.30.300.3
cisplatin4.83.04.651.60.31.81.91.01.9
Sutent>100>10>100>10>100>10
RJY-130.40.00.42.14.40.10.20.10.2
Revilidin>100.0>10>100.0>10>100>10
Thalitomid>100.0>10>100.0>10>100>10
MYJ-16>100.0>10>100.0>10>100>10
Carboplatin>100.0>10>100.0>10>100>10
Oxaliplatin>100.0>107.40.87.09.80.0110.0

ההשפעה של לפטיניב על החלבונים המוחדרים Twist, Snail ו- Slug בתאי Tubo:

ההשערה שלנו הייתה כי החדרת חלבוני ה- EMT  (Twist, Snail ו- (Slug לתאי TUBO תגרום לביטוי יתר של החלבונים הללו בתאים מה שיפעיל תהליך ה-EMT ויביא ליצירת תאים עמידים לתרופה הטיפולית הקיימת Lapatinib. המבחנים הקודמים (טריפן בלו ו-XTT) שבדקו את יכולת ההישרדות של תאי סרטן השד השונים וכושר יכולתם לדגול במצע אגר רך ((Soft Agar לאחר טיפול עם Lapatinib, לא הראו קבלת תאים עמידים לתרופה המעכבת. במבחן הבאה רצינו לבדוק השפעת הטיפול עם Lapatinib על ביטוי החלבונים המוחדרים: Twist, Snail ו- Slug בתאי סרטן השד השונים.

בניסוי ווסטרן בלוט ראשוני שתוצאותיו מוצגים , בדקנו את ההשפעה של לפטיניב על ביטוי החלבונים (Snail, Twist) בתאי סרטן השד TUBO, TUBO/Twist, TUBO /Snail אשר עברו ולא עברו טיפול מקדים עם טמוקסיפין. דוגמאות התאים, טופלו עם לפטיניב  בריכוז 1µM למשך שעה. לבדיקת ביטוי החלבונים השתמשנו בנוגדנים ראשוניים כנגד Snail וכנגד ERα. על פי התוצאות אנו רואים ירידה בביטוי החלבונים Twist, Snail לאחר טיפול עם לפטיניב רק בדוגמאות התאים אשר עברו טיפול מקדים עם טמוקסיפין.

בניסוי ווסטרן בלוט שני שתוצאותיו מוצגים, בדקנו את ההשפעה של לפטיניב על ביטוי החלבונים Snail, Twist ו-Slug בתאי סרטן השד TUBO, TUBO/Twist, TUBO /Snail ו- TUBO /Slug בריכוזי לפטיניב שונים. דוגמאות התאים שעברו טיפול מקדים עם טמוקסיפין למשך כ-3 שבועות, טופלו עם לפטיניב  בשני ריכוזים (1µM ו- 5µM) למשך 3 שעות. עקבנו אחרי רמת הביטוי של החלבונים  (Snail, Twist, Slug) על ידי השימוש בנוגדנים כנגד (Snail, ERα, Slug). על פי התוצאות אנו רואים ירידה בביטוי החלבון Snail בריכוז הנמוך של Lapatinib (1µM), וירידה בביטוי החלבונים Twist ו-Slug בריכוז הגבוה (5µM) של התרופה.

לסיכום, טיפול עם לפטיניב תלוי בריכוז מוריד את הביטוי של החלבונים Twist, Snail ו- Slugבתאי TUBO השונים.

מעקב אחריSlug בנוכחות מעכביGSKß3ו-p.AKT בתאיםTubo/Slug:

התאים TUBO/Slug שעברו טיפול מקדים עם טמוקסיפן, טופלו עם מעכבי p.AKT ומעכבי GSKß3. בניסוי הווסטרן בלוט עקבנו אחרי רמת הביטוי של החלבון Slug   

בנוגדנים מתאימים נגדם. התוצאות מוצגות .

  • התגובה נגד החלבון Slug :

בכל דוגמאות התאים של TUBO/Slug הופיע בנד אחד המתאים גודלו לגודל של החלבון Slug.הבנד החזק ביותר הופיע בדוגמת התאים הראשונה שלא עברה שום  טיפול, הבנד נחלש בדוגמאת התאים השנייה שעברה טיפול על ידי GSKß3 –I ובדוגמה השלישית שעברה טיפול על ידי p.AKT-I. הירידה ברמת הביטוי בדוגמאות אלה הייתה זהה זה לזה אך מזערית בהשוואה לדוגמת התאים הראשונה שלא עברה טיפול עלי ידי מעכבים אלו. בדוגמת התאים הרביעית שעברה טיפול עם לפטיניב, הבנד של Slug נחלש משמעותית בהשוואה לבנד שהתקבל בדואמת התאים הראשונה הלא מטופלת עם לפטיניב. בדוגמה החמישית שטופלו עם לפטיניב ו- GSKß3-Iהבנד ירד עד העלמות, רמת החלבון בדוגמה זו הייתה הנמוכה ביותר. בדוגמת התאים השישית שטופלה עם לפטיניב ו- p.AKT-I, עוצמת הבנד הינה דומה לעוצמת הבנד שהופיע בדוגמה הרביעית המטופלת על ידי לפטיניב בלבד וחלשה יותר מעוצמת הבנד שהופיע בדוגמה הראשונה שלא עברה שום טיפול.

לסיכום, טיפול עם לפטיניב הוריד את רמת הביטוי של החלבון Slug .בנוכחות p.AKT-I הביטוי של Slug ירד (כצפוי), אך ביטויו לא עלה בנוכחות GSKß3 –I.

דיון ומסקנות:

תאים סרטניים עלולים לחדור אל כלי הדם, להיכנס דרכם למחזור הדם ולהגיע לאיברים נוספים. באיברים האלה התאים עשויים להיקלט, להתחלק וליצור גידול נוסף – תהליך שנקרא “מטסטזיס”, או שליחת גרורות . טיפול יכול להיות יעיל כל עוד התאים הסרטניים לא גרמו ליצירה של כלי דם חדשים ולא שלחו גרורות, אפשר להסיר בניתוח את הגידול כולו. אך אחרי שהתהליכים האלה החלו יש צורך בטיפולים מערכתיים – כימותרפיה והקרנות – שאינם מבחינים בין התאים הבריאים בגוף לתאי הסרטן. תהליך פיזור הגרורות, זהו אירוע קריטי בגידולים סרטניים, מפני שהגרורות הן הגורם העיקרי למוות מסרטן – רק 31% ממקרי המוות נובעים מהגידול הראשוני ואילו 81% נובעים מגרורות. מניעת גרורות חשובה במיוחד וזו על מנת להקטין את התמותה הקשורה למחלות הסרטניות. ההתפשטות של תאי סרטן לאיברים מרוחקים מהווה אתגר קליני מרכזי בטיפול בסרטן.

תהליך מעבר התאים מאפיתליאלים למזנכימאלים EMT (epithelial-to-mesenchymal transition) התגלה כמפתח רגולטורי של שליחת גרורות בסוגים מסוימים של סרטן על ידי הענקת פנוטיפ פולשני. בנוסף, התהליך הינו מעורב ביצירת תאי גזע סרטניים ותורם רבות להתנגדות לטיפול. מסלול EMT הוא עניין טיפולי רב בטיפול בסרטן ויכול להתמקד או במניעת הפצת הגידול בחולים עם סיכון גבוה לפתח גרורות או להפחתת התאים הסרטניים הגרורתיים וצמצום הגרורות בחולים אשר נמצאים בשלב מתקדם יותר של המחלה.

מטרת העבודה העיקרת הינה למצוא תרופות או חומרים אלטרנטיבים שיראו יעילות גבוהה בטיפול בסרטן הגרורתי. מציאת טיפולים כאלה תתבצע על ידי סריקה רחבה של חומרים אם תרופות קיימות ואם חומרי טבע שונים ולבדוק תגובת התאים בעלי יכולת גרורתית לפעול נגדם. במילים אחרות למצוא חומרים בעלי השפעה מיוחדת על התאים הגרורתיים. אנו רוצים לחקור את השפעת נוכחותם של החלבון  Slug על תאי סרטן שד עכברים TUBO המבטאים ביתר את הרצפטור HER2, כלומר לבדוק אם ביטוי יתר של החלבונים דוחף את תאי הסרטן לתהליךEMT  ומעודד אותם להפוך לתאי גזע סרטניים עמידים לתרופות הקיימות . נעקוב אחרי התנהגותם של תאי Tubo/Slug בהשוואה לתאי Tubo המבטאים ביתר Snail  או Twist1 שכבר קיימים במעבדה שלנו.

על מנת לבצע את הסריקה עומד בפנינו אתגר נוסף, אתגר זה יתקיים ביצירת מודל מעבדתי של תאים אשר ידמו את השלב הגרורתי ויציגו עמידות בפני תרופות.

תאי המודל מהם נייצר את המודל הגרורתי הם אלו של סרטן השד Tubo.

בקרב נשים, סרטן השד הינו הנפוץ ביותר, ברחבי העולם מספר המאובחנות כלוקות במחלה הוא 1.5 מליון נשים בעוד והמחלה הורגת כ- 460 אלף נשים מידי שנה. בישראל מדי שנה נפטרות קרוב ל-1,000 חולות עקב המחלה. בסרטן השד המחלה מתחילה בשד אך הם שולחים גרורות אל האברים השונים בגוף.

  1. הכנת תאי המודל המדמים את המצב הגרורתי

על מנת לקחת חלק במטסטזיס על  התא  להיות בעל תכולה אנזימטית וגנטית שתאפשר את תהליכי ההתפשטות. תהליך הEMT  ידוע כי הגורם לשליחת גרורות. הוא, נצפה בתחילה במהלך התפתחות העוברית והוא מנוצל על ידי הגוף במקרה של סרטן [44]. לאחרונה, נמצא קשר בין מעבר תאי האפיתל למזנכימה (EMT) למאפייני תאי גזע סרטניים(CSC) (cancer stem cells) הידועים כמפתחי עמידות נגד הטיפולים [45][46]. קשר זה עדיין לא ברור, מצד אחד נראה כי תאי גזע סרטניים נוטים יותר לעבור EMT , מצד שניEMT  מעניק תאי סרטן עם מאפיינים של תאי גזע סרטניים [46]. גורמי שעתוק רבים, כוללים בין היתר פקטורים ממשפחת ה- Snail, Slug ו-Twist, מגיבים לגירויים סביבתיים ומתפקדים כמתגים מולקולריים בכך הם מפעילים תהליך ה- EMT[43]. בנוסף להיותם מבקרי תהליך ה-EMT והיותם קשורים במצב הגרורתי, חלבונים אלה נמצאו כמעורבים ברכישת פנוטיפ פולשני במגוון סוגי סרטן כולל סרטן השד והם מקנים לתאי הסרטן התנהגות אגרסיבית יותר [30][31][43]. בנוסף, בבדיקות מולקולריות חוקרים הראו ביטוי גבוהה בחלבוניםSnail  ו-Twist בתאים אשר נלקחו מחולים אשר פיתחו עמידות לתרופות. על סמך נתונים אלה, ההנחה שלנו כי התבטאות יתר של הגנים: Twist, Snail, Slug בתאי סרטן השד תביא להפעלת תהליך ה-EMT, ליצירת תאי גזע סרטניים וכתוצאה מכך להתפתחות עמידות לתרופות אנטי סרטניות.

התוצאות של western  blot הראו כי התאים של  סרטן השד TUBO אשר עבר אינפקציה עם החלבונים Twist, Snail ביטאו את הגנים ברמת השיעתוק וברמת החלבון . תאי סרטן השד שהתקבלו הם  TUBO/Twistו-TUBO/Snail. בנוסף, התוצאות הראו גם כי קווי התאים TUBO/Slug  שהתקבלו בהמשך, ביטאו ביתר את החלבון Slug בקוו הראשון ושתי החלבונים Twist ו-Slug בקוו השני.

  1. בדיקת תכונות ומאפיינים של תאי המודל החדשים

במחקר זה, התבקשנו לבדוק את השינויים המולקולריים והפונקציונליים ואת הפוטנציאל הגרורתי של קווי התאים החדשים של סרטן השד ביחס לתאי המקור.

  • מעקב אחרי סמנים מולקולריים המאפיינים את תהליך ה-EMT ותאי גזע סרטנים

בתהליך הגרורתי בעט התמרה סרטנית, התאים מתנתקים מהגידול הראשוני ונודדים לרקמות ולאיברים השונים בהם הם מתבססים והופכים לגידולים משניים. תהליך זה, מורכב ממספר צעדים כולל: פלישה, חדירות, קולוניזציה וניידות; שלבים אלו צריכים להתקיים על מנת לעורר גידול גרורתי [18-20]. תהליך ה-EMT  אשר ידוע כי המעורב העיקרי בשליחת גרורות מתאפיין באובדן של סמנים אפיטליאלים ובקבלת סמנים מזנכימאלים, והוא מתאר מכלול של שינויים למשל בביטוי של החלבונים Vimentin, E-Cadherin  ו- N-cadherin[46].E-Cadherin  למשל, חלבון התאחיזה בין תאים, ביטויו הגבוהה מאפיין תאים אפיטליאלים. לעומת זאת N-cadherin, שתאים רוכשים כאשר מאבדים את ה- E-Cadherinבתהליך המטאסטזה, מאפיין תאים מזנכימאלים. החלבונים Snail, Twist, Vimentin מעורבים בוויסות קאדהרינים בפרט  E-cadherin והם מבוטאים בתאים מזנכימאלים[23][21], [22]. ביטוי יתר של Vimentin, ירידה בביטוי E-Cadherin  ועלייה בביטוי N-cadherinמעידים על מעבר מזנכימאלי. מכאן המעקב המולקולרי אחרי הביטוי שלהם בתאים השונים של סרטן השד ושל סרטן הפרוסטטה היותם הסמנים המולקולרים הטובים ביותר לרכישת מאפיינים מזנכימלים. הבדיקה המולקולרית התבצעה בשיטת ה-RT-PCR וב- time PCR , התוצאות הראו שהגן Vimentin התבטא בכל דגימות התאים של סרטן השד (Tubo, TUBO/Twist, TUBO/Snail ו- Tubo/Slug) באותה תדירות.

הזכרנו כבר שקיים קשר בין המעבר האפיתלי אל המזנכימלי (EMT) ורכישת תכונות של תאי גזע סרטניים (CSC) המעורבים בהתנגדות לטיפולים. בנוסף לרכישת מאפיינים גרורתיים בתאי המודל שלנו, שאפנו בנוסף שהתאים ירכשו מאפיינים של תאי גזע. חוקרים הצליחו לבודד CSC  ע”י מעקב אחרי מרקרים חוץ ממברנליים המזוהים עם תאי גזע. אחד המרקרים למשל הינו הרצפטור הממברנאלי CD184, הוא התבטא ביתר ואפיין גידולים גרורתייםואגרסיבים של סרטן שד.

ביטוי יתר של טרנפורטרים כמו ABCG2 מעידים על קבלתם של תאי גזע סרטניים (תאים עמידים)[46].ABCG2 שימש כסמן למעבר התאים הסרטניים לתאי גזע .

מהבדיקות המולקולארית אלו, אם מעקב אחרי מרקרים של EMT  ואם מעקב אחרי מרקרים של תאי גזע אי אפשר להסיק מסקנות. ב-rt-pct, הבדיקות הן ראשוניות וטרם היו חזרות על התוצאות המתארות את רמת השעתוק. לא ראינו שינוי בעוצמת הבנדים (rt-pct) וברמת השיעתוק (real time pcr) של vimentin בין הדוגמאות של התאים החדשים ותאי המקור של סרטן השד ושל סרטן הפרוסטטה. ישנם דיווחים על כך שהביטוי של E-cadherin לא עבר דאון-רגולציה בתאים גרורתיים אגרסיבים, ודיווח נוסף על מקרה בו E-cadherin ו- vimentin, התבטאו באותה תדירות בתאים שנלקחו מגידול ראשוני של סרטן שד ובתאים אגרסיבים יותר שנלקחו מגרורות בקשרי הלימפה לעומת ההתבטאות השונה של מרקרים אחרים של EMT. הם הסבירו זאת כי הביטוי של הגנים הללו תלוי בגורמים שונים, למשל vimentin ביטויו חולף ומבוקר על ידי הסביבה בו הוא נמצא [100]. יתכן שבניסויים שבדקו את נוכחות הגנים 2ABCG,  E-Cadherin ו-  N-cadherinהפריימרים לא עבדו, יש צורך להזמין פריימרים חדשים ולעקוב שוב אחרי הביטוי שלהם. בכל זאת הבדיקה המולקולרית אינה מספיקה, יש לבדוק פרופיל גנטי מגוון וגדול יותר.

  • בדיקת עמידות של התאים השונים של סרטן השד לתרופה הטיפולית “לפטיניב”:

נאמר לעיל כי הגנים Twist, Snail ו- Slug מעורבים במצב הגרורתי בסרטן השד היותם מקדמים את תהליך ה- EMT . בנוסף, הזכרנו כי התהליך זה  מגביר את הפולשנות ומקנה תאים סרטניים עם מאפיינים של תאי גזע סרטניים ((CSC, התאים החשודים כמקור להתנגדות לטיפולים כימותרפיים, להקרנות ולהישנות הגידול הסרטני. עקב החדרת הגנים Twist, Snail ו- Slug לתאי סרטן השד, הגנים צפויים להפעיל את תהליך ה-EMT והתאים TUBO/Twist,  TUBO/Snailו– TUBO/Slug צפויים לקבל תכונות של תאי גזע סרטניים, הידועים כעמידים יותר בפני תרופות. תאי המודל של סרטן השד TUBO הם HER-2 חיובי והם רגישים ללפטיניב[41].הפרוטו-אונקוגן 2ERBB (HER2)מקודד לחלבון – רצפטור טירוזין קינאז הגן שייך למשפחת הרצפטורים EGFR – Epidermal Growth Factor Receptor. הרצפטור HER-2 עובר זירחון בשייר הטירוזין כתוצאה מקישור לחלבון זהה (יצירת הומודימר) או כתוצאה מקישור לחלבונים אחרים מן המשפחה (יצירת הטרודימר) [41]. אוטופוספורילציה וטרנספוספורילציה בשייר הטירוזין של HER-2מוביל להפעלת המסלולים כמו (mitogen-activated protein kinase Ras/Raf) וכמו phosphoinositide 3-kinase(PI3K)/Akt לפרוליפרציה ולחיות התא (שגיאה! ארגומנט בורר לא ידוע.). לפטיניב התרופה המעכבת של סרטן השד (HER2) חיובי, מעכבת את מסלול העברת האות דרך עיכוב הפוספורילציה של רצפטור (HER2) לאחר שנצמד לרצפטור אחר מהמשפחה (מתחרה עם ATP על אתר הקישור ברצפטור)[18], [19]. עיכוב הפוספורילציה של הרצפטור, ימנע למשל את זירחונום של הקינאזותPI3K ו- Akt בכך נמנע האות לפרוליפרציה ולחיות התאים המועבר במסלול PI3K/Akt. בעבודה זו, בדקנו אם ביטוי יתר של החלבונים Twist, Snail ו- Slug בתאי סרטן שד HER2 חיובי (TUBO) משפיע על תגובתם לתרופה הטיפולית (לפטיניב). בדקנו זאת במבחנים הבודקים חיוניות תאים,( XTT, טריפאן בלו) ובאגר רך.

תוצאות הניסויים . לא הראו השפעה מיוחדת של החלבונים Twist, Snail ו- Slug על תגובת תאי סרטן השד החדשים לתרופה הטיפולית לפטיניב. לפי גרף העמודות המתאר את ממוצעי ה- IC50 של ניסויי ה-XTT של לפטיניב בתאים  TUBO, TUBO/Twist, TUBO/Snail, TUBO/Slug ו-TUBO/Twist-Slug(שגיאה! מקור ההפניה לא נמצא.) נראה שאין הבדל ביכולתה של Lapatinib לעכב את תאי Tubo השונים. ההבדלים אם ישנם הם קטנים ויתכן ולא משמעותיים מבחינה סטטיסטית. גם כן, ערכי IC50שהתקבלו במבחני טריפאן בלו אינם שונים משמעותית מבחינה סטטיסטית , והם מאשרות את התוצאות של ניסויי ה-XTT. בניסויי ההמשך אנו עקבנו אחרי רמת הביטוי של החלבונים (Twist, Snail ו- Slug) שהוחדרו , התוצאות הראו כי טיפול עם לפטיניב מוריד את רמת הביטוי שלהם, וזו סיבה אפשרית כי אי קבלת עמידות נובעת מהטיפול עצמו ולא כי לא התרחש שינוי בתאים.

  1. תגובת תאי המודל החדשים של סרטן השד לטיפולים שונים:

לאחר יצירת תאי המודל של סרטן השד נשאלת השאלה, כיצד מתבטאת ההחדרה הגנטית של Twist,  Snailו- Slugבתאים ואם היא משפיעה על רגישותם לטיפולים. בשרשרת ניסויים נבדקה תגובת תאי סרטן השד (TUBO/Twist, TUBO/Snail ו-TUBO/Slug) לתרופות קיימות. בדיקת השפעת הגנים, כללה סריקה של מספר תרופות ובדיקת פעילותן על התאים בשיטת ה-XTT אשר בודק עיכוב גדילת תאים.

החומרים וחומרי הטבע שנבדקו בתאי סרטן השד, חלקם נבחר היותם התרופות הקיימות נגד סרטנים שונים או היותם התרופות של מחלות שונות. Imatinib ו- Dasatinib אלו התרופות העיקריות המטפלות בסרטן הדם מסוגCML  (לויקמיה מיאלואידית כרונית). Oxaliplatin, Carboplatin ו-Cisplatin, תרופות המטפלות בסרטן השחלה.Crizotinib מטפלת בסרטן הריאות. התרופות Gemzar ו- Ara-C מטפלות במחלת ה- AIDS . Berberine ו- Curcumin אלה הם חומרי טבע.

רגישות תאי המודל החדשים ל Gemzar– ,Gemzarהאנלוג ל- deoxycytidine שמופעל על ידי קינאזdeoxycytidine (dCK) למונופוספט ולאחר מכן לטריפוספט, מוביל לנזקים ב-DNA מה שגורם להפסקת השיעתוקוהתירגום. על פי הגרף (איור (7.A, לא תועדה השפעה מיוחדת של Gemzar על קווי התאים החדשים של סרטן השד. רגישות התאים לתרופה הייתה זהה בתאים TUBO/Twist, TUBO/Snail ו-TUBO/Slug ובתאי המקור TUBO.

רגישות תאי המודל החדשים לציספלטין- בתאי סרטן השד התוצאות (טבלה 1) הראו כי התאים TUBO/Twist, TUBO/Snail הינם יותר רגישים לציספלטין (פי 2.5 ו- 3 בהתאמה) מאשר התאים הרגילים TUBO. בשל סטיות תקן גבוהה בתאי הביקורת של סרטן השד קשה לקבוע אם תוצאות אלה אמיתית וקשה לומר בוודאות כי ציספלטין משפיעה באופן מיוחד על קווי התאים החדשים של סרטן השד.

רגישות תאי המודל החדשים לכריזוטיניבול דסטיניב-כריזוטיניב הינה תרופה אשר ניתנת לחולי סרטן הריאות, ודסטיניב הינה תרופה אשר ניתנת לחולי לויקמיה מיאלואידית כרונית (CML). התוצאות בשגיאה! ארגומנט בורר לא ידוע., הראו כי תאי סרטן השד TUBO/Snailו- TUBO/Twistהם עמידים פי 1.6 ו- 1.4 יותר מתאי TUBOלקריזוטיניב, ועמידים פי 4  ו- 3 ~ לדסטיניב בהתאמה. קשה להסיק מסקנות בשל סטיית תקן גבוהה בתאי TUBO.

רגישות תאי המודל החדשים לשאר החומרים– התוצאות לא הראו תגובה מיוחדת או שונה של התאים החדשים של סרטן השד  TUBO/Snailו- TUBO/Twist לשאר החומרים שנסרקו, Carboplatin , MYJ-16 , Thalitomid ,Revilidin , Sutent. בתאי טובו, תרופות אחרות כמו Gemzar, Ara-C, Fu5, הצליחו לעכב את תאי סרטן השד השונים בריכוזים נמוכים, בלי שום קשר לסוג התא אם רגיל או מבטא את הגנים Snail ו- Twist.

פרק זה, מטרתו לאלתר חומרים שהשפעתם תהיה גבוהה יותר על התאים החדשים אשר מבטאים את הגנים Snail ו-Twist . במחקר זה נסרקו מס’ חומרים, מתוכם נמצא חומר ציספלטין הראה השפעה מיוחדת והתאים החדשים של סרטן השד היו יותר רגישים, אך בשל סטיית תקן גבוהה יחסית בתאי הביקורת Tubo אי אפשר לקבל בוודאות תוצאות אלה.

  1. ההשפעה של לפטיניב על החלבונים Twist, Snail ו- Slug:

ההשערה שלנו הייתה כי החדרת חלבוני ה- EMT  (Twist, Snail ו- (Slug לתאי TUBO תגרום לביטוי יתר של החלבונים הללו בתאים מה שיפעיל תהליך ה-EMT ויביא ליצירת תאים עמידים לתרופה הטיפולית הקיימת Lapatinib. המבחנים הקודמים (טריפן בלו ו-XTT) שבדקו את יכולת ההישרדות של תאי סרטן השד השונים וכושר יכולתם לדגול במצע אגר רך ((Soft Agar לאחר טיפול עם Lapatinib, לא הראו קבלת תאים עמידים לתרופה המעכבת.

בדקנו את ההשפעה של לפטיניב על ביטוי החלבונים Snail, Twist ו-Slug בתאי סרטן השד TUBO, TUBO/Twist, TUBO /Snail ו- TUBO /Slug בריכוזי לפטיניב שונים. בסדרת ניסיונות מצאנו שנוכחותה של התרופה Lapatinib הביאה לירידה ברמת החלבונים Snail/Twist ו- Slugביעילות שונה. נוכחות Lapatinib במשך 3 שעות הביאה לירידה במשמעותית ברמת החלבון Snail בריכוז של 1µM לעומת החלבונים Twist ו- Slug שדרשו ריכוז של   5µM.  פעילותם של שלושת החלבונים גם מבוקרת על ידי יציבותם.

חשיבותה של התרופה היותה מעכבת את החלבונים Twist, Snail ו- Slug בתאי סרטן שונים, הינה האפשרות לנצלה כמעכבת של תהליך תהליך ה-EMT. בעזרת בדיקות נוספות שיאששו את הממצאים ש-Lapatinib מעכב את תהליך ה-EMT, נוכל להשתמש בתרופה זו לא רק כמעכב טירוזין קינאז בגידולים מוצקים בסרטן השד אלה גם כמעכבת של תהליך יצירת הגרורות בסרטן שד ובסוגי סרטן שונים[8].

סיכום:

בעבודה זו רצינו ליצור תאי מודל של סרטן השד עם יכולות של ניידות, פולשנות ואגרסיביות שתחקה את המצב הגרורתי עם מאפיינים של תאי גזע הסרטניים, וזו דרך החדרת הגנים המרכזיים המבקרים את תהליך ה- EMT (Slug,Snail, Twist). במעבדה יצרנו קווי התאים החדשים TUBO/Twist, TUBO/Snail, TUBO/Slug  .על ידי החדרת גן יחיד או שתי גנים לתאי סרטן השד TUBO מסוג Her2+. בשלב הבא רצינו לבדוק את השינויים המולקולריים והפונקציונליים של קווי התאים החדשים . התוצאות הראו כי הגנים Snail, Slug ו-Twist גרמו לעלייה ברמת החלבון המזורחןERBB2  בתאי טובו השונים, ביטוי גבוהה של ERBB2 נמצא כי מעורב בדאון-רגולציה של E-cadherin [103]. בניסויים שבדקו תגובת התאים ללפטיניב, לא העידו על קבלת עמידות בתאים החדשים בפני התרופה בעוד וניסויי המשך הראו ירידה ברמת החלבונים המוחדרת לאחר טיפול עם לפטיניב וזו סיבה אפשרית לאי קבלת עמידות. הניסוי שבדק פולשנות וכושר תנועה לא הראה שינוי פונקציונלי בתאים אליהם הוחדרו הגנים Snail ו-Twist. נסרקו חומרים רבים כוללים תרופות קיימות וחומרי טבע שונים, רוב הטיפולים לא ציספלטין הראה השפעה מיוחדת על התאים החדשים של סרטן השד היו יותר רגישים לתרופה, אך בשל סטיית תקן גבוהה יחסית בתאי הביקורת Tubo אי אפשר לקבל בוודאות תוצאות אלה.

במחקר זה, אי אפשר לשלול לגמרי כי התאים החדשים עברו שינוי עקב ההחדרה הגנטית של Snail, Twist ו- slug. יתכן שהתרחשו שינויים, ונדרשים ניסויים נוספים ומעמיקים יותר על מנת לאמת אותם. ויתכן כי השינויים שהתרחשו הם לא מספיקים על מנת לגרום לתאים לעבור תהליךEMT  ולקבל תכונות של תאי גזע. כלומר, על מנת לרכוש את היכולת הגרורתית כנראה יש צורך בביטוי כמה גנים ביחד, והדבר אינו תלוי בגן אחד.מומלץ לבדוק את ההשפעה של השילובים השונים של הגנים (Snail, Twist, Slug).תוספת של לפטיניב מורידה את הביטוי של Twist, Snail ו- Slug, יתכן כי בשל רמה קטנה הם לא מצליחים להשרות שינויים כולל עמידות. יכול להיות כי לפטיניב מוריד את רמת הביטוי של הגנים דרך פקטור שמבקר את השעתוק שלהם HSF-1.

4. מקורות ספרות:

Martin, T.A., et al., Expression of the transcription factors snail, slug, and twist and their clinical significance in human breast cancer. Ann Surg Oncol, 2005. 12(6): p. 488-96.

Dyall, S., S.A. Gayther, and D. Dafou, Cancer stem cells and epithelial ovarian cancer.J Oncol, 2010. 2010.

סיוע בעבודות אקדמיות
סיוע בעבודות סמינריון